Materiales y métodos

1. MALDI-TOF-MS:

Se colocó 1µl del sobrenadante en el electrodo multi-well del equipo. Posteriormemnte se agregó 1 μl de la matriz ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico (HCCA) y se dejó evaporar. Una vez que la placa estuviera completamente seca se colocó en el equipo Microflex LT (software: flexControl 3.4.135.0, disparos de láser: 240, repetición de láser: 60, modo de ionización: LD+; rango: 2-20 kDa, método: MBT_FC.par), para realizar la adquisición manual de los espectros, con un intensidad del laser del 60%.

2. Análisis de datos:

a) Obtención de la matriz de señales.

El pre-procesamiento de los espectros se realizó mediante el software RStudio. Este esquema de trabajo finaliza con la obtención de una matriz de intensidades, en la cuál las columnas contienen los distintos picos (m/z), las filas los distintos sobrenadantes (correspondientes a las distintas condiciones y líneas celulares) y las celdas los valores de intensidad. El algoritmo Binary Discriminant analysis (BDA) permite hacer una transformación binaria de las intensidades, la misma consta en el cálculo del promedio de intensidad para cada columna (pico), luego sí los valores puntuales de esa columna superan ese valor medio se le asigna 1, caso contrario 0. A esta matriz se la denomina dicotomizada. Además se hizo una transformación binaria de las intensidades, en la mismase asigna 1 si el valor de intensidad es mayor que 0 y si es 0 se asigna 0.

b) Selección de picos diferenciales

Se realizó el análisis supervisados (BDA). El objetivo es buscar las señales espectrales (picos) que presentan diferencias significativas entre los grupos en cuestión.

c) Análisis no supervisados

Se analizaron los perfiles de los espectros por medio del algoritmo hierarchical k-means clustering usando las bases de intensidad, dicotomizada y binaria, pero sólo con los picos que presentaron diferencias significativas. Esta estrategia apunta a reducir las dimensiones de los datos y comprobar de modo gráfico la capacidad de los picos seleccionados para dividir los grupos.

d. Asignación bio-informática

Se utilizo las base de datos Uniprot con los siguientes filtros: 1) Organismo: Homo sapiens (Human) [9606], 2) PM encontrado y 3) Proteínas de secreción

Análisis no supervisados

HeatMap Matriz dicotomizada

  • El grupo Cnt difiere de los grupos Tto y Basal. El análisis se hará entre los grupos Basal y Tto.

Hierarchical k-means clustering

  • Cada punto del gráfico representa el promedio de las intensidades de 2 espectros.

  • El método de partición seleccionado fue hierarchical k-means clustering, posteriormente las observaciones se representaron usando análisis de componentes principales; las dimensiones 1 y 2 explican cerca del 80% de la variación total de los datos.

  • Se puede observar una separación en dos clusters no superpuestos. Si bien la homogeneidad de dichos clusters no es total, se genera una separación de los dos grupos altamente satisfactoria.

Selección de picos diferenciales

BDA

  • El gráfico muestra los 25 picos con expresión diferencial detectados por el algoritmo BDA. En este gráfico se comparan los t-scores de cada pico (m/z) entre y dentro los distintos grupos. Valores positivos y mayores a 2.5 de este score indican presencia significativa, mientras que valores negativos y menores a -2.5 indican ausencia significativa en ese grupo.

Visualización de espectros

Espectro promedio

  • Se calculó la media de intensidad por pico según cada grupo, y se gráfico ese valor medio en función de los picos. Los colores muestran la pertenencia a los distintos grupos. Las líneas punteadas indican los 6 picos diferenciales entre los grupos.

Asignación bio-informática

2007

  • No encontrada

4992

2377

2735

2026

2421

Análisis no supervisados

HeatMap Matriz dicotomizada

  • El grupo Cnt difiere de los grupos Tto y Basal

Hierarchical k-means clustering

  • Cada punto del gráfico representa el promedio de las intensidades de 2 espectros.

  • El método de partición seleccionado fue hierarchical k-means clustering, posteriormente las observaciones se representaron usando análisis de componentes principales; las dimensiones 1 y 2 explican cerca del 85% de la variación total de los datos.

  • La separación origina dos clusters altamente homogeneos.

Selección de picos diferenciales

BDA

  • El gráfico muestra los 25 picos con expresión diferencial detectados por el algoritmo BDA. En este gráfico se comparan los t-scores de cada pico (m/z) entre y dentro los distintos grupos. Valores positivos y mayores a 2.5 de este score indican presencia significativa, mientras que valores negativos y menores a -2.5 indican ausencia significativa en ese grupo.

Visualización de espectros

Espectro promedio

  • Se calculó la media de intensidad por pico según cada grupo, y se gráfico ese valor medio en función de los picos. Los colores muestran la pertenencia a los distintos grupos. Las líneas punteadas indican los 6 picos diferenciales entre los grupos.

Asignación bio-informática

3440

3576

3600

2498

2582

2810

Análisis no supervisados

HeatMap Matriz dicotomizada

  • El grupo Cnt difiere de los grupos Tto y Basal

Hierarchical k-means clustering

  • Cada punto del gráfico representa el promedio de las intensidades de 2 espectros.

  • El método de partición seleccionado fue hierarchical k-means clustering, posteriormente las observaciones se representaron usando análisis de componentes principales; las dimensiones 1 y 2 explican cerca del 78% de la variación total de los datos.

  • Se puede observar una separación en dos clusters no superpuestos. Si bien la homogeneidad del cluster Tto (turqueza) no es absoluta, sólo uno de los replicados del grupo Basal cae dentro de este cluster.

Selección de picos diferenciales

BDA

  • El gráfico muestra los 25 picos con expresión diferencial detectados por el algoritmo BDA. En este gráfico se comparan los t-scores de cada pico (m/z) entre y dentro los distintos grupos. Valores positivos y mayores a 2.5 de este score indican presencia significativa, mientras que valores negativos y menores a -2.5 indican ausencia significativa en ese grupo.

Visualización de espectros

Espectro promedio

  • Se calculó la media de intensidad por pico según cada grupo, y se gráfico ese valor medio en función de los picos. Los colores muestran la pertenencia a los distintos grupos. Las líneas punteadas indican los 6 picos diferenciales entre los grupos.

Asignación bio-informática

4254

3000

2005

  • No detectada

3063

2831

2644

Análisis en red

Networks

  • La red intenta mostrar la relación existente entre los 15 picos discriminantes de cada uno de los distintos modelos BDA probados. Las referencias de los nombres de los modelos son los siguientes: NIAP.wt.bda.Basal (Línea celular NIAP.wt, algortimo BDA y el pico que tiene asociado está diferencialmente presente en el grupo Basal). Los valores de los picos se dividieron por 10, se redondearon y se multiplicaron por 10; de esta forma los valores de picos en la red en realidad cubren un intervalo de 10 Da.

  • Los colores muestran aquellos picos discriminantes que se me mantienen entre las distintas líneas celulares y condiciones. Puede verse que sólo la condición Tto (tratamiento) comparte picos entre las distintas líneas celulares, estos picos están remarcados con color rojo.

  • El intervalo 2440 (corresponde a los picos 2444 y 2440) es compartido por las líneas celulares PANC y NIAP.wt, mientras que el intervalo 2350 (corresponde a los picos 2351 y 2352) es compartido por las líneas celulares PANC y NIAP.kd. EL intervalo 3270 (corresponde a los picos 3267 y 3268) es compartido por las líneas NIAP.kd y NIAP.wt

  • Uniprot_link_2440

  • Uniprot_link_3271. Uniprot_link_Isoform_3271. Fragmentos.

  • Uniprot_link_2353. Uniprot_link_Homolog_2353. Fragmento.